南京市犬幽门螺旋杆菌感染的流行病学调查及其防治效果的研究王雪平，姚大伟，崔军，周振雷*，侯加法（南京农业大学动物医学院，江苏南京）摘要：[目的]调查南京市犬幽门螺旋杆菌（Helicobacterpylori，Hp）的感染率和特征，研究益生菌和抗生素在Hp治疗过程中的作用，评估Hp菌株的耐药情况。[方法]试验采用了胶体金检测、PCR扩增和细菌分离纯化培养等Hp菌株鉴定方法，体内试验检测益生菌和抗生素的治疗效果，体外药敏试验评估菌株耐药性强弱。[结果]南京市犬Hp总感染率为75.87%（/），不同生活环境下感染率为57.14%~80.65%；螺旋杆菌的感染率为87.10%（/)，Hp占其中87.96%（95/）；此外，临床上采用抗生素辅以益生菌治疗能够明显提高Hp的根除率；Hp菌株对标准三联用药方案中的克拉霉素、阿莫西林耐药性增高。[结论]生活环境对犬的Hp感染有明显的影响，良好的生活饲养环境可有效降低犬的Hp感染率；临床抗生素治疗时辅以健胃乐益生菌能够有效提升Hp的根除率，同时减少Hp菌株对其敏感抗生素耐药性的产生。关键词：幽门螺旋杆菌；感染率；耐药性；益生菌

幽门螺旋杆菌（Helicobacterpylori，Hp）是螺旋杆菌属的一种，为革兰氏阴性杆菌，一般长7~10μm，有四到六个螺旋，年被成功分离，是当今世界上公认的感染率较高的上消化道病重要致病细菌之一[1]。Hp可诱导急慢性胃炎、胃、十二指肠溃疡、胃癌、胃黏膜相关性淋巴瘤等的发生，年被世界卫生组织（WHO）列为人类胃癌的I类致癌源[2,3]。迄今为止，被分离报道的螺旋杆菌至少有40种[4]，它们主要分布在一些哺乳动物以及鸟类胃肠道内，其中大多数已被证实为胃或肝等脏器相关疾病的致病原[5]。统计资料显示，全球人螺旋杆菌感染率为40%~80%，发展中国家的感染率(90%)普遍高于发达国家（20%）[6]，其中幽门螺旋杆菌感染占近50%[7]。

近年来，单独使用益生菌或与抗生素结合治疗Hp感染的研究比较广泛。益生菌可通过直接竞争营养物质与附着空间等对Hp黏附进行干扰或阻断；或者通过刺激胃黏蛋白的表达稳定肠道屏障，刺激局部免疫应答和抗氧化物质的释放，减少致病细菌的过度生长；也可通过竞争营养物质、调节宿主免疫与诱导抑制毒素作用于肠道微生物群。研究表明，益生菌单独使用能在一定程度上减少Hp，但无法根除[8]；益生菌的使用能够减少抗生素产生副作用，但在提高Hp根除率上仍有争议[9,10]。

伴侣动物饲养者与伴侣动物之间可相互传播Hp，相互感染率最高可达%。从犬、猫胃肠道分离到的致病性螺旋杆菌有4种（包括Hp），严重危害伴侣动物健康[11]。目前，中国宠物犬Hp感染流行病学调查及其相关的病例研究尚未见报道。详细调查宠物犬Hp感染的流行病学特征、对比研究相关药品的防治效果，对指导兽医临床医生针对性地有效治疗宠物犬Hp感染具有重要的临床价值。本研究调查了南京地区犬Hp感染的发生率及其流行病学特征，并在此基础上，选择合适的阳性犬给予益生菌及抗生素治疗，评估其治疗效果，为犬Hp感染的防控研究提供临床依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品采集无菌棉签采集南京市不同生活环境犬直肠新鲜粪便样品共份进行编号与分组。A：南京市流浪犬收容基地犬新鲜粪便样品份（母犬份，公犬份）（记为No.1）；B：南京3医院（分别记为No.2，No.3，No.4）临床就诊犬新鲜粪便样品份及驻院犬粪便样品14份（记为No.5）；C：经主人同意，随机采集南京市非门诊宠物犬（7d~90d未使用过抗生素）粪便样本24份（记为No.6）。上述采集的粪便样本分装于加有μL无菌生理盐水的EP管中，4°C冷藏送至实验室检测。所有受检犬年龄在1月龄至12岁不等（流浪犬收容基地犬年龄健康状况不详）。

1.1.2主要试剂及其制备幽门螺旋杆菌ATCC本试验室保存。幽门螺旋杆菌粪便抗原检测试剂盒购自南京倍耀科技有限公司；粪便基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；PCRPremixExTaq购自宝生物（大连）有限公司；微需氧产气袋及培养罐均购自上海宝曼生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

按照文献制备方法制备尿素酶试剂[12]，Hp选择/非选择培养基[13~15]，Hp保菌液[15]。

1.2方法

1.2.1Hp抗原的检测对A组份样品和B组77份样品低温保存后迅速送至实验室检测。按照幽门螺旋杆菌粪便抗原检测试剂盒说明操作，取适量样品液加入检测板加样孔，10~20min判读结果，并统计阳性率。

对B组剩余份样品，每管取μL粪便样品液，按照粪便基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作，提取粪便基因组DNA，提取的DNA保存于-20°C备用，用于PCR扩增。根据幽门螺旋杆菌ATCC16SrRNA基因，使用primerPremier5设计螺旋杆菌属通用引物（表1）。根据H.pyloriUreB基因设计能特异性扩增幽门螺旋杆菌的引物。25μLPCR反应体系：2×PCRPremixExTaq12.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，DNA模板1μL，加水至总体积为25μL。反应程序为：95°C预变性5min，95°C变性10s、56°C退火30s、72°C延伸30s（1min40s，UreB基因），重复30个循环，最后72°C延伸5min。反应后将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在凝胶成像系统下观察并记录结果。

1.2.2Hp的根除动物试验随机选取临床感染Hp阳性犬，经主人同意，按就诊先后顺序进行随机分组对比用药，每组20例。方案一为标准三联用药，即奥美拉唑（omeprazole,OME，北京太洋药业有限公司），剂量为0.4mg/kg；克拉霉素（clarithromycin,CLA，江西汇仁药业有限公司），剂量为7.5mg/kg；阿莫西林（amoxicillin，AMO，哈药集团三精明水药业有限公司），剂量为15mg/kg。上述药物口服给药，每日两次，连用4周，定期复诊，记录Hp根除率。方案二是在方案一基础上添加健胃乐益生菌（上海湃特科技有限公司），抗生素给药2小时后，按照每千克体重0.8g益生菌口服给药。

1.2.3Hp培养及鉴定C组新鲜样品于采集后2h内涂布Hp选择性培养基上，倒置放于培养罐中，放入微需氧菌产气袋后迅速密封，置于37°C培养3~5天[13,16]。挑取可疑菌落进行划线分离、纯化。观察菌落、细菌形态，并进行生化鉴定（尿素酶、氧化酶、过氧化氢酶）。

1.2.4药敏试验称取2.81g布氏肉汤干粉，加入90mL蒸馏水，高压灭菌，放至室温后加入10mL马血清，混匀，无菌条件下倒入90mm培养皿中，每板3mL制成液体薄层培养基[17]。挑取Hp单菌落接种到薄层培养基中，37°C密封培养24h，将菌液调整成0.5麦氏单位菌悬液，涂布非选择性培养基，室温干燥5min后，贴上药敏纸片，每种药敏片做3个重复。37°C微需氧条件下培养2~3d，测量抑菌圈直径判断药物敏感性。相关文献指出，Hp对喹诺酮类、四环素类以及呋喃唑酮类药物耐药性较低，是提高Hp根除率的较好选择[18]。因此，本试验选择表4药物进行药敏试验，并进行耐药统计。

2结果

2.1南京市犬幽门螺旋杆菌感染率

所有参与试验的犬Hp检测统计结果见表2。本试验共有份样品，阳性样品数量为份，南京市犬Hp阳性率为75.87%（/），南京市不同生活环境犬Hp阳性率范围为57.14%~80.65%。其中，以流浪犬收容基地（No.1）的感染率最高，为80.65%；住院犬（No.5）感染率最低，为57.14%。医院就诊犬共只，Hp感染阳性率范围在71.21%~74.29%，综合阳性率为72.64%（/）。

进一步采用PCR方法对B组份样品感染幽门螺旋杆菌的情况进行调查，HpUreB和H.spp.16SrRNAPCR电泳结果见图1和图2。检测到螺旋杆菌属细菌阳性样品为份，阳性率87.10%（/），其中犬幽门螺旋杆菌阳性95份，76.61%（95/），占螺旋杆菌属阳性样品的87.96%（95/）。说明南京地区犬感染的螺旋杆菌多为幽门螺旋杆菌。

图1HpUreBPCR电泳结果

Fig.1TheresultsofthePCRforHpusingagarosgelelectrophoresis

M:DL0bpmarker1-8被检样品Testsample；9阴性对照Negativecontrol；10阳性对照Positivecontrol；产物大小Productsizebp

图2H.spp.16SrRNAPCR电泳结果

Fig.1TheresultsofthePCRforH.sppusingagarosgelelectrophoresis

M:DL0bpmarker1-8被检样品Testsample；9阴性对照Negativecontrol；10阳性对照Positivecontrol;产物大小Productsizebp

2.2Hp根除动物试验结果

Hp阳性犬采用下述方案治疗后的第14d和28d，采用幽门螺旋杆菌粪便抗原检测试剂盒检测Hp抗原，判断治疗效果。参与方案一治疗阳性犬20例。用药一个疗程（14d）后，8例转阴，根除率为40%（8/20）；用药两疗程（28d）后，16例转阴，根除率为80%（16/20）。参与方案二治疗阳性犬20例，用药一疗程后，14例转阴，根除率为70%（14/20）；用药两疗程后，20例转阴，根除率为%。

2.3Hp分离纯化培养及鉴定结果

Hp菌株分离培养3~5天后，可在培养皿中观察到呈针尖状，无色透明露滴样，边缘整齐，中间稍突起单个散在菌落。革兰氏染色镜检可见菌呈红色C形、U形、S形或者海鸥飞翔状杆状，该菌落为革兰氏阴性杆菌。快速尿素酶试验可见阳性反应结果试剂变为红色，阴性反应结果为橙黄色；氧化酶检测试验可见接触细菌部位在5min内变为蓝色或深蓝色；过氧化氢酶检测试验阳性结果可见铂环挑取细菌加入3%过氧化氢试剂中后，迅速产生大量气泡。菌落形态、菌体形态、生化检验等指标均符合幽门螺旋杆菌的特性。

2.4Hp药敏试验结果

15株幽门螺旋杆菌对11种抗菌药物敏感性试验统计结果见表5。根据受试药物对已鉴定菌株的抑菌圈直径大小对照相应的药物耐药性判断标准进行抗菌药物敏感性评估。药敏试验分析结果显示，喹诺酮类抗生素（如左氧氟沙星）和呋喃唑酮类抗生素（如呋喃唑酮）的耐药性最低，均为20%。标准用药方案中使用的克拉霉素[19]，阿莫西林耐药率分别为26.67%和33.33%，均高于20%，利福霉素类[20]（利福平）和四环素类抗生素（如四环素）也显示出较高耐药性（33.33%）。其余抗生素耐药性更高，甚至达53.33%。试验结果提示，除标准用药方案治疗Hp中所用抗生素外，左氧氟沙星和呋喃唑酮可替代其进行Hp感染的临床治疗。

3讨论

本研究使用了多种试验方法检测犬粪便样品中的幽门螺旋杆菌，并最终确定了南京市犬幽门螺旋杆菌的感染现状。流浪犬基地的Hp感染总阳性率为80.65％，较南京市犬Hp感染综合阳性率75.87%高出4.78%；医院门诊犬，平均感染率为72.64%。感染率最低的是非门诊宠物犬和住院犬。以上研究表明，不同生活环境下的犬Hp感染率存在较大差异。

流浪犬收容基地所有犬分属六个场区，场区内粪便清理不及时，饲养密集，群体饲养等问题给致病菌的滋生和犬与犬之间的相互感染提供了有利条件，使群体感染率较高。临床就诊犬多数并非由于胃肠道症状进行就诊，但其感染率仅次于流浪犬基地，这可能是由于机体处于亚健康状态，自身免疫力降低，动物机体抵御致病菌入侵的能力显著下降，增加了感染Hp的风险[21]。从非门诊宠物犬以及住院犬的感染情况我们发现：定时作息，规律饮食和锻炼，保持生活环境卫生，能够有效提高犬自身机体抵抗力，降低Hp的感染率[22]；经常使用各类抗生素消除炎症能够降低体内细菌感染率，但经常使用抗生素必定会导致机体内致病菌耐药菌株的产生[23]。所以保证犬的环境卫生和规律生活是保证犬免于病菌感染的有效措施。

PCR检测结果显示；螺旋杆菌感染率87.10%明显高于Hp的感染率76.61%，说明犬在感染了幽门螺旋杆菌的同时还一定程度上混合感染了其同一种属的其他杆菌。混合感染所占比例相对较小，不同病原菌间的相互作用和致病性尚不明确，有待进一步研究。

从Hp动物根除试验结果可以看出，本研究中所用益生菌（健胃乐益生菌）辅助治疗Hp感染在第一、二疗程中都显著高于非益生菌组（方案一）。有研究表明，益生菌的使用能够有效提高Hp感染的根除率，降低治疗过程中的不良反应和毒副作用[19]。在此过程中，我们还发现，健胃乐益生菌适口性好，宠物食用依从性高，在使用抗生素后2小时服用，能够有效改善犬胃肠道状态，排便较使用前更顺畅，便量增加，排便时间缩短，胃肠道负担减轻，为药物更好地治疗感染提供了必要的辅助性条件。

Hp感染率的提高很大程度上是由于耐药菌株的产生。克拉霉素和阿莫西林是Hp治疗过程中标准三联用药方案的组成部分，在人医临床已经使用二十多年，并取得了良好效果[24,25]。但随着克拉霉素和阿莫西林的使用频率也越来越高，动物用药不规范、滥用抗生素，这也一定程度上导致了Hp对克拉霉素、阿莫西林耐药性的提高[26,27]，本试验也显示幽门螺旋杆菌对这两种抗生素存在一定程度的耐药。近年来，针对Hp耐药率上升，寻求更合适的临床用药治疗方案是提高Hp根除率的有效途径[27]。另外，药物内脏生物利用率的差异，高抗药性的遗传多样性，地区与地区之间用药方案效果的不同，都强调需要根据当地抗生素耐药性，制定用药方案，提高Hp根除的成功率[28]。左氧氟沙星因其抗菌谱广、毒性小，近年来被广泛用于Hp感染的治疗研究[29]。从本研究的药敏结果可以看出，Hp对左氧氟沙星和呋喃唑酮的耐药性低，敏感性较高，毒性小，其个别不良反应也能有效应对等特点，这两种药可以应用于临床治疗，具备替代耐药性不断提高的克拉霉素和阿莫西林的潜力。

本试验通过调查南京市犬幽门螺旋杆菌流行情况，发现犬感染Hp和其所生活的环境卫生状况密切相关。所以避免接触垃圾等致病菌滋生严重的不卫生东西[21]，使犬养成良好的生活习惯，定时锻炼，提高机体抵抗力都能有效降低Hp的感染风险。同时，也应当减少对犬的抗生素预防性用药，降低细菌耐药性的产生。针对临床感染病例，可使用左氧氟沙星结合呋喃唑酮治疗Hp感染，同时辅以健胃乐益生菌调理肠胃，加快Hp的根除速度，有效治疗Hp感染疾病，降低抗生素治疗过程中副作用发生的频率和严重程度，减少机体内细菌耐药性产生的几率。

参考文献

Reference:

[1]WarrenJR,MarshallBJ.Unidentifiedcurvedbacilliongastricepitheliuminactivechronicgastritis[J].Lancet,,1():–

[2]SipponenP,Hyv?rinenH.RoleofHelicobacterpyloriinthepathogenesisofgastritis,pepticulcerandgastriccancer[J].ScandJGastroenterolSuppl,,:3-6

[3]StaceyHarbour,PhilipSutton.ImmunogenicityandpathogenicityofHelicobacterinfectionsofveterinaryanimals[J].VetImmunolImmunopathol,8,(3-4):-

[4]BaeleM,DecostereA,VandammeP,etal.IsolationandcharacterizationofHelicobactersuissp.nov.frompigstomachs[J].IntJSystEvolMicrobiol,8,58(Pt6):–

[5]AnsorgR,VonHeineggEH,VonRecklinghausenG.CatOwners’RiskofAcquiringaHelicobacterpyloriinfection[J].ZentralblBakteriol,,(1):–

[6]FoxJG,WangTC.Inflammation,atrophy,andgastriccancer[J].JClinInvest,7,(1):60-69

[7]BodeG,RothenbacherD,BrennerH,etal.PetsarenotariskfactorforHelicobacterpyloriinfectioninyoungchildren:resultsofapopulation-basedstudyinSouthernGermany.PediatrInfectDis[J],,17(10):–

[8]Vitor,ValeFF.AlternativetherapiesforHelicobacterpylori:probioticsandphytomedicine[J].FEMSImmunolMedMicrobiol,1,63(2):-

[9]LionettiE,IndrioF,PavoneL,BorrelliG,etal.RoleofprobioticsinpediatricpatientswithHelicobacterpyloriinfection:a







































北京白癜风的医院
治疗白癜风有什么偏方吗


转载请注明:http://www.ukgmg.com//mjcczz/4562.html